کروماتوگرافی ستونی تکنیکی برای جداسازی مخلوط مواد شیمیایی و بیولوژیک به ترکیبات مجزا است. کروماتوگرافی ستونی یک روش پرکاربرد برای خالص سازی یا جداسازی مخلوط ترکیبات شیمیایی در آزمایشگاه است.

کروماتوگرافی ستونی شامل دو فاز است: یک فاز متحرک و یک فاز ثابت پیوسته. فاز ثابت جامد و فاز متحرک مایع است. مخلوط مورد آزمایش توسط  فاز متحرک در فاز ثابت حرکت می کند و بسته به درجه چسبندگی هر جزء در نمونه یا مخلوط جدا می شود.

برای انجام کروماتوگرافی ستونی از یک لوله شیشه ای با ورودی دایره ای بزرگ و یک خروجی کوچک یا شیر استفاده می شود. ستون به صورت عمودی روی پایه قرار می گیرد که در آن خروجی رو به پایین است.

یک تکه پشم پنبه به خروجی وارد شده تا مانع از فرار فاز ثابت از ستون شود. دو روش برای آماده سازی ستون با سیلیس یا آلومینا وجود دارد:

روش خشک: ابتدا ستون با سیلیس پودری خشک پر می شود. سپس فاز متحرک، یک حلال مناسب از داخل آن رد می شود تا تمام سیلیس خیس و ته نشین شود. از این مرحله تا انتها، ستون همیشه باید با حلال مرطوب بماند.

روش مرطوب: ابتدا دوغابی از سیلیس و حلال تهیه می شود و سپس با استفاده از قیف بر روی ستون ریخته می شود. تا زمانی که سیلیس در آن ته نشین شود باید از حلال بیشتری استفاده شود.

روش انجام کروماتوگرافی ستونی

مرحله 1: فاز متحرک حلال یا حل شونده است. سطح بالایی فاز متحرک باید مانند فاز ثابت باشد. یعنی فاز ثابت باید با حلال خیس شود. در این مرحله مخلوط مورد آزمایش را از بالای ستون به گونه ای اضافه می کنند که سطح بالایی آن به هم نخورد. با باز کردن شیر زیرین اجازه داده می شود تا روی سطح سیلیس جذب شود.

مرحله 2: سپس حلال یا مخلوط با لمس کنار ستون شیشه ای به آرامی و با احتیاط به آن اضافه می شود تا سطح بالایی فاز ثابت به هم نخورد. حلال به تعداد دفعات مورد نیاز در طول فرآیند بارها اضافه می شود.

مرحله 3: ترکیبات موجود در مخلوط بسته به قطبیت مولکول نمونه، همراه با ماده شوینده حرکت می کنند. اجزای غیر قطبی سریعتر از مولفه های قطبی حرکت می کنند.

فرض کنید مخلوط  حاوی سه ترکیب آبی، قرمز و سبز باشد. با توجه به قطبیت ترتیب این ترکیبات آبی> قرمز> سبز است. این بدان معناست که آبی قطبی ترین ترکیب است و بنابراین تمایل کمتری به حرکت در کنار فاز متحرک خواهد داشت.

مرحله 4: ترکیب سبز رنگ اول حرکت می کند زیرا قطبیت آن نسبت به دو مورد دیگر کمتر است. هنگامی که نزدیک به انتهای ستون است، یک لوله آزمایش تمیز برای جمع آوری نمونه سبز رنگ گرفته می شود. پس از این، رنگ قرمز و در نهایت قطبی ترین ترکیب یعنی نمونه آبی جمع آوری می شود، همه در لوله های آزمایش جداگانه. بنابراین یک مخلوط ترکیبی با استفاده از کروماتوگرافی ستونی جدا یا خالص می شود.

آنالیز نتایج در کروماتوگرافی ستونی

هنگامی که اجزای نمونه را در لیوان های مختلف جمع آوری کردید، می توانید آنها را بیشتر تجزیه و تحلیل کنید. به عنوان مثال، می توانید طیف سنجی جرمی یا کروماتوگرافی لایه نازک را روی یکی از اجزاء انجام دهید تا هویت آن مشخص شود. می توانید با حذف حلال آن را تصفیه کنید. یکی از راه های انجام این کار از طریق تقطیر است. همچنین می توانید به سادگی برخی از واکنش های اولیه لوله آزمایش را انجام دهید تا سرنخ هایی در مورد ساختار و واکنش پذیری جزء بدست آورید.

انواع کروماتوگرافی ستونی

کروماتوگرافی ستونی بسته روش جریان حلال در ستون به دو دسته تقسیم می شود. اگر به حلال اجازه داده شود تحت نیروی گرانش زمین یا نفوذ به پایین ستون جریان یابد، به آن گرانشی می گویند. اگر حلال با فشار هوای مثبت در ستون حرکت کند آن را کروماتوگرافی فلاش می نامند که در آزمایشگاه های تحقیقاتی شیمی آلی استفاده می شود.

مزایای کروماتوگرافی ستونی

اکنون می دانیم که کروماتوگرافی ستونی چگونه کار می کند بنابراین می توانیم برخی از مزایای آن را ذکر کنیم.

• شما می توانید مقادیر زیادی از یک نمونه را تجزیه و تحلیل کنید. این در هنگام جداسازی مخلوط ها مفید است.
• فاز ثابت معمولاً کم هزینه است و به راحتی قابل دفع است.
• بسته به حلال مورد استفاده، کاربردهای بالقوه زیادی دارد.

موارد استفاده از کروماتوگرافی ستونی

کروماتوگرافی ستونی در دنیای واقعی طیف وسیعی از کاربردها را دارد که شامل:

• جداسازی مواد فعال
• جداسازی مخلوط هایی مانند ترکیبی از اسیدهای آمینه.
• جداسازی متابولیت ها از نمونه های بیولوژیکی
• حذف ناخالصی ها.